MPB：微生物所王军组-人类肠道病毒粒子富集及纳米孔测序
人类肠道病毒粒子富集及纳米孔测序
Enrichment and Nanopore Sequencing of Human Gut Virus-like Particles
曹佳宝1, 2, #，张雨青1, 2, #，赵娜1，王军1, *
1病原微生物与免疫学重点实验室，中国科学院微生物研究所，北京；2中国科学院大学，北京
*通讯作者邮箱：junwang@im.ac.cn
#共同第一作者/同等贡献
摘要：
实验背景：病毒作为微生物组的重要组成部分，具有较高的多样性，但是其含量较低，直接测序得到的病毒序列极少，从而限制了病毒组研究。
实验原理：通过给定范围的孔径使符合范围的病毒粒子能顺利通过，初步过滤非病毒粒子。然后，根据病毒粒子的大小、密度和形状等物理特性对其进行沉降富集，最终得到纯净的病毒粒子。
实验目的：使用人类粪便样本对肠道病毒粒子进行富集，同时提取病毒核酸并进行扩增和纯化，最后上机测序。
实验结果：该方法可有效提高病毒粒子的含量，病毒有效数据提升至70%左右（包含未知序列），为病毒组的下游分析奠定基础。同时，运用该方法获得的病毒cDNA扩增产物除用于Nanopore测序，还可用于Illumina测序。
关键词：人类肠道病毒组，VLPs，富集，扩增
材料与试剂
1.0.45 μm PVDF滤器 (Millex-HV)
2.各种型号枪头
3.1.5 ml、15 ml、50 ml离心管
4.超速离心管 (Beckman, catalog number: 355654)
5.TURBO DNase I (Invitrogen, catalog number: AM2238)
6.RNase A (QIAGEN)
7.10 mM dNTP Mix (Promega, catalog number: U151B)
8.M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, catalog number: M170B)
9.Klenow fragment (Taraka, catalog number: 2140A)
10.QIAamp MinElute Virus Spin Kit (QIAGEN, catalog number: 57704)
11.DEPC水 (Ambion, catalog number: AM9922)
12.KOD-Plus DNA polymerase (Toyobo, catalog number: KOD-201)
13.琼脂糖 (Invitrogen, catalog number: 75510-019)
14.QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, catalog number: 28704)
15.Ligation Sequencing Kit (Oxford Nanopore, catalog number: SQK-LSK109)
16.Native Barcoding Kit (Oxford Nanopore, catalog number: EXP-NBD104)
17.NEBNext FFPE DNA Repair Mix (NEB, catalog number: M6630L)
18.Ultra II End-prep enzyme Mix (NEB, catalog number: E7372AA)
19.Blunt/TA Ligase Master Mix (NEB, catalog number: M0367L)
20.Quick T4 DNA Ligase (NEB, catalog number: E6057AA)
21.核酸染料 (Mei5bio, catalog number: MF079-plus-05)
22.6× DNA Loading Buffer (Tiangen, catalog number: RT201-01)
23.Trans 15K DNA Marker (全式金生物，catalog number: BM161-01)
24.Primer Rrm (5′-GACCATCTAGCGACCTCCAC - NNNNNN-3′)
25.Primer Rm (5′-GCCGGAGCTCTGCAGAATTC-3′)
26.DNA beads (Beckman, catalog number:A63987)
27.Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, catalog number: Q32854)
28.Ribonuclease Inhibitor (Promega, catalog number: N2518)
29.PBS缓冲液 (见溶液配方)
30.TBE缓冲液 (见溶液配方)
仪器设备
1.冷冻离心机 (Beckman Coulter, model: AllegraTM X-22R)
2.高速冷冻离心机 (Thermo Heraeus FERSCO 17 Centrifuge)
3.超速冷冻离心机 (Beckman Coulter, model: XP-100)
4.掌上离心机
5.高压蒸汽灭菌锅
6.PCR仪
7.凝胶成像系统
8.电泳仪
9.恒温水浴锅
10.超净工作台
11.PromethION测序仪
12.制胶槽和梳子
13.手术刀
14.磁力架
15.电子天平
实验步骤
1.病毒粒子 (VLPs) 富集（图1）
1.1取1~1.5 g粪便于干净无菌的离心管，在15 ml无菌PBS中重悬并充分混匀；
1.24,500 rpm 4 °C离心10分钟，取上清于新的无菌的离心管；
1.3重复离心一次；
1.4将上清液用无菌0.45 μm PVDF 滤膜过滤至新的干净无菌的离心管；
1.5将滤液再次用无菌0.45 μm PVDF 滤膜过滤；
1.6滤液转移至灭菌的超速离心管内，加无菌PBS至超过离心管体积2/3处，配平；
1.7180,000 × g 4 °C离心3 h；
1.8弃上清，将离心管倒置在干净吸水纸以流尽残液；
1.9加150 μl无菌PBS重悬沉淀并转移至新的无菌1.5 ml离心管；
1.10 250 μl无菌PBS重复冲洗超速离心管并转移至1.5 ml离心管；
1.11 加入8U的TURBO DNase I、45 μl 10× TURBO DNase I Buffer和20 U 的RNase A在37 °C下水浴处理30分钟；
2.病毒核酸提取
处理后的病毒粒子取140~200 μl使用QIAamp MinElute Virus Spin Kit试剂盒提取核酸，剩余病毒粒子-80 °C储存。
3.反转录为cDNA
取13 μl核酸按照如下体系进行反转录，剩余核酸-80 °C储存。
第一链：
RNA | 13 μl |
Rrm primer | 1 μl |
65 °C 5 min，冰浴2 min；
5× MLV Buffer | 4 μl |
10 mM dNTP Mix | 1 μl |
RNA Inhibitor | 0.5 μl |
M-MLV | 1 μl |
25 °C 10 min；37 °C 60 min；95 °C 10 min；4°C
第二链：
Rrm Primer | 0.5 μl |
10mM dNTP Mix | 1 μl |
10× Buffer | 2.5 μl |
Klenow fragment | 2 μl |
25 °C 10 min；37 °C 60 min；75 °C 10 min；4 °C
4.PCR扩增
取反转录产物按照如下体系和程序进行PCR扩增，一般为25 μl体系 (为获得足够质量的扩增产物，可增大到200 μl体系):
体系为：
Rm Primer | 1 μl |
2mM dNTP Mix | 1.25 μl |
10x Buffer | 2.5 μl |
Mg2+ | 1 μl |
KOD酶 | 0.5 μl |
反转录产物 | 1 μl |
ddH2O | 17.75 μl |
扩增程序为：
Step1: | 95 °C | 5 min | 预变性 |
Step2: | 95 °C | 30 s | 变性 |
Step3: | 54 °C | 1 min | 退火 |
Step4: | 72 °C | 30 s | 延伸 |
Step5: | Go to Step 2-4 | 34 个循环 | |
Step6: | 72 °C | 10 min | 充分延伸 |
Step7: | 4 °C | ∞ | 反应终止，低温保存 |
PCR 体系配好后轻微涡旋混匀，分装到八连管中，稍离心，放入PCR仪中，运行程序。
5.琼脂糖凝胶电泳和胶回收（图2）
5.1用1× TBE配制2%浓度琼脂糖胶 (200 ml TBE加4 g琼脂糖)，微波炉加热煮沸至琼脂糖完全溶解，自来水冷却至约60~70 °C (体感可承受)，加入20 μl核酸染料，摇匀后倒入放有制胶托板的制胶槽中，插入梳子 (300 μl)，冷却凝固 20 min；
5.2将200 μl PCR反应液加入100 μl 3x Loading Buffer混匀后全部加入到制好的琼脂糖胶孔中，加入Marker，200 V电泳10 min；
5.3取出琼脂糖胶放入凝胶成像系统中拍照，检查扩增产物目标条带。目的条带回收纯化：参照Marker条带子量大小，用手术刀在紫外发光仪上切取大于500 bp的条带胶块，参照QIAquick Gel Extraction Kit说明书回收纯化目的基因片段，并用Qubit 4.0检测胶回收产物浓度；
6.文库制备及测序
回收后的核酸按照ONT PromthION DNA建库说明书进行基因文库制备和上机测序。
图1. 病毒富集、核酸提取纯化及测序流程(Cao等， 2020)
图2. 病毒核酸扩增后的琼脂糖凝胶电泳
图3. 主要病毒组成及相对丰度(Cao等， 2020)
注意事项
1.病毒粒子富集过程中应保证在无菌环境中进行。
2.PBS缓冲液重悬粪便时应充分悬浮，将粪便与食物残渣等冲洗干净，可多次冲洗至上清液色浅澄清后进行下一步离心，也应当注意控制溶液体积。
3.在超速离心过程中离心管中液体应超过离心管容积的2/3，转速不宜过高，可适当延长离心时间以使病毒粒子沉淀更充分 (Thurber等， 2009)。
4.病毒核酸在反转录扩增中应避免反复用枪头吹吸，可以选择轻轻拍打的方式混匀。扩增过程为了保证核酸产量，可以扩增50 μl体系四组共200 μl总体系 (Froussard 1993)。
5.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳呈现为弥散条带，为了降低回收胶的质量，选择高浓度琼脂糖凝胶和大电压进行电泳，Marker中500 bp条带充分跑开时即可切胶回收，丢弃小于500 bp的条带，其余条带全部切下回收。回收时裂胶液体积过大，需反复多次添加至同一吸附柱离心。
溶液配方
1.TBE缓冲液
先配制10× TBE缓冲液。称取108 g Tris，7.44 g Na2EDTA·2H2O，55 g硼酸，加去离子水800 ml充分溶解，再定容至1 L，121 °C，20 min灭菌后室温保存，使用时用去离子水稀释10倍。
2.PBS缓冲液 (pH 7.2~7.4)：
称取KH2PO4 0.24 g，Na2HPO4 1.44 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，加去离子水约800 ml充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1 L。
致谢
该项工作得到中国国家重点研究发展计划 (批准号2018YFC2000500)，中国科学院战略重点研究计划 (批准号XDB29020000) 和国家自然科学基金 (批准号31771481和91857101) 的支持。
参考文献
1. Cao, J., Zhang, Y., Dai, M., Xu, J., Chen, L., Zhang, F., Zhao, N. and Wang, J. (2020). Profiling of Human Gut Virome with Oxford Nanopore Technology. Medicine in Microecology: 100012. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.medmic.2020.100012
2. Froussard, P. (1993). rPCR: a powerful tool for random amplification of whole RNA sequences. Genome Research 2: 185-190. https://doi.org/10.1101/gr.2.3.185
3. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L. and Rohwer, F. (2009). Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nature Protocols 4(4): 470-483. https://doi.org/10.1038/nprot.2009.10
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